連續(xù)層析是生物制藥下游工藝的新趨勢(shì)，它通過(guò)多柱切換技術(shù)，使層析過(guò)程在不同階段（如上樣、洗淋、洗脫、再生）同時(shí)進(jìn)行，提高了介質(zhì)利用率和生產(chǎn)效率，減少了設(shè)備占地面積和緩沖液消耗。這種模式在抗體的大規(guī)模生產(chǎn)中正展現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，面對(duì)細(xì)胞...

細(xì)胞破碎后，混合物中包含可溶性蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞器碎片及完整的細(xì)胞壁等不溶物。離心是分離這些組分較常用且高效的方法。通過(guò)施加強(qiáng)大的離心力，密度較大的顆粒（如細(xì)胞碎片、細(xì)胞核）會(huì)快速沉降形成沉淀，而可溶性蛋白質(zhì)則保留在上清液中。差速離心通過(guò)一系列遞增的離心力，可...

等電點(diǎn)沉淀是一種基于蛋白質(zhì)在pH等于其等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零、溶解度比較低的原理進(jìn)行的粗分離方法。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH，可以使一類等電點(diǎn)相近的蛋白質(zhì)或雜質(zhì)沉淀出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)初步的富集或去除。該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，常作為大規(guī)模純化中的初始步驟。共價(jià)層析是一種特殊的親和...

金屬螯合親和層析（IMAC）是重組蛋白純化中較常用的親和技術(shù)，利用His標(biāo)簽與二價(jià)金屬離子（Ni2?、Co2?、Cu2?）的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)分離。樹脂表面偶聯(lián)亞氨基二乙酸（IDA）或 nitrilotriacetic acid（NTA）基團(tuán)，可螯合金屬離子。Hi...

固定化金屬離子親和層析是重組蛋白純化中較廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。其原理是將螯合劑固定于介質(zhì)上，螯合鎳離子、鈷離子等過(guò)渡金屬離子，這些金屬離子又能與重組蛋白末端融合的寡聚組氨酸標(biāo)簽（如6xHis標(biāo)簽）特異性結(jié)合。結(jié)合后，通過(guò)提高咪唑濃度（咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合金屬離子位點(diǎn)）...

親和層析是所有層析方法中通常能提供比較高純度和富集倍數(shù)的一步。其原理是利用目標(biāo)蛋白與固定相上配體之間高度特異性的、可逆的生物化學(xué)相互作用。較經(jīng)典的例子是固定化金屬離子親和層析（IMAC），用于純化帶有組氨酸標(biāo)簽（His-tag）的重組蛋白，其與柱上的鎳離子或鈷...

雖然電泳（如SDS-PAGE， 等電聚焦， 天然PAGE）主要用于分析，但它們也可用于小規(guī)模的制備或特殊用途的純化。制備型電泳可以在非變性條件下分離蛋白質(zhì)，用于后續(xù)的活性研究或抗原制備。電洗脫是從凝膠切片中回收蛋白質(zhì)的常用方法。更高級(jí)的系統(tǒng)，如制備型等電聚焦或...

許多功能性蛋白質(zhì)是以多亞基復(fù)合物的形式存在的。純化這類復(fù)合物的挑戰(zhàn)在于保持其組裝的完整性和穩(wěn)定性。策略通常包括：1）共表達(dá)所有亞基，以期在細(xì)胞內(nèi)正確組裝；2）使用親和標(biāo)簽標(biāo)記其中一個(gè)亞基，利用該標(biāo)簽純化整個(gè)復(fù)合物；3）在整個(gè)純化過(guò)程中使用溫和的、接近生理?xiàng)l件的...

FPLC和HPLC都是采用泵系統(tǒng)來(lái)精確控制流動(dòng)相輸送的層析技術(shù)，區(qū)別于依靠重力流動(dòng)的傳統(tǒng)柱層析。FPLC系統(tǒng)專為生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸）設(shè)計(jì)，使用生物相容性的材料（如PEEK）流路，以中低壓（通常<5 MPa）運(yùn)行，采用溫和的瓊脂糖或聚合物基質(zhì)樹脂，旨在保...

連續(xù)層析是生物制藥下游工藝的新趨勢(shì)，它通過(guò)多柱切換技術(shù)，使層析過(guò)程在不同階段（如上樣、洗淋、洗脫、再生）同時(shí)進(jìn)行，提高了介質(zhì)利用率和生產(chǎn)效率，減少了設(shè)備占地面積和緩沖液消耗。這種模式在抗體的大規(guī)模生產(chǎn)中正展現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，面對(duì)細(xì)胞...

尺寸排阻層析，也稱為凝膠過(guò)濾，是根據(jù)蛋白質(zhì)流體力學(xué)體積（或表觀分子量）進(jìn)行分離的獨(dú)特方法。其固定相是由高度多孔的惰性顆粒組成。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過(guò)層析柱時(shí)，大于孔徑的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間的空隙流過(guò)，因而較早被洗脫。較小的蛋白質(zhì)可以進(jìn)入部分或全部孔...

蛋白質(zhì)聚集是純化過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，表現(xiàn)為溶液渾濁或形成沉淀，導(dǎo)致活性喪失和產(chǎn)量下降。聚集可由多種應(yīng)力引發(fā)：暴露于氣-液界面（攪拌、起泡）、疏水表面吸附、反復(fù)凍融、過(guò)高濃度、偏離適pH或鹽濃度等。抑制策略包括：添加溫和去垢劑（如Tween-20， Triton ...

純化得到的寶貴蛋白質(zhì)需要妥善儲(chǔ)存以維持其長(zhǎng)期穩(wěn)定性。儲(chǔ)存條件取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。短期儲(chǔ)存（數(shù)天至數(shù)周）可在4°C下進(jìn)行，并加入抗菌劑（如疊氮鈉）。長(zhǎng)期儲(chǔ)存通常采用冷凍?？焖倮鋬霾⒃?80°C保存是常用的方法。為了防止冷凍和解凍過(guò)程中因冰晶形成、pH變化和相分離...

層析是現(xiàn)代蛋白質(zhì)純化的關(guān)鍵技術(shù)，其提供了基于不同物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行高分辨率分離的能力。所有層析系統(tǒng)都包含兩個(gè)基本相：固定相和流動(dòng)相。固定相通常是一種被填充在柱子里的基質(zhì)（樹脂），其表面經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，具有特定的功能基團(tuán)。流動(dòng)相是攜帶樣品并流經(jīng)柱子的液體。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混...

單克隆抗體的生產(chǎn)已經(jīng)發(fā)展出高度成熟的平臺(tái)化純化工藝。其關(guān)鍵是蛋白質(zhì)A親和層析。蛋白質(zhì)A能高特異性、高親和力地結(jié)合大多數(shù)IgG的Fc區(qū)域，使得從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一步捕獲抗體達(dá)到極高的純度（>95%）。隨后，為了去除殘留的宿主細(xì)胞蛋白、DNA、聚合體、浸出的蛋白質(zhì)...

質(zhì)譜（MS）已成為蛋白質(zhì)純化過(guò)程中不可或缺的分析工具。其應(yīng)用包括：1）鑒定純化產(chǎn)物，通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）確認(rèn)目標(biāo)蛋白的身份，并檢測(cè)是否存在截短或修飾形式；2）評(píng)估純度，能檢測(cè)到SDS-PAGE無(wú)法觀察到的微量雜質(zhì)...

離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)表面凈電荷的不同進(jìn)行分離的強(qiáng)有力工具。固定相是帶有電荷的基團(tuán)：陰離子交換劑帶正電（如DEAE, Q），結(jié)合帶負(fù)電的蛋白質(zhì)；陽(yáng)離子交換劑帶負(fù)電（如CM, SP），結(jié)合帶正電的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在偏離其等電點(diǎn)（pI）的pH條件下會(huì)帶上凈電荷。當(dāng)...

對(duì)于分析和制備型層析，自行裝填層析柱能提供更大的靈活性并降低成本。均勻、無(wú)氣泡的柱床是獲得高分辨率的關(guān)鍵。裝柱后，需用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如鹽溶液）測(cè)定柱效，即理論塔板數(shù)，并計(jì)算不對(duì)稱因子。一個(gè)性能良好的色譜柱應(yīng)具有高柱效和對(duì)稱的峰形，這表明裝填均勻，能實(shí)現(xiàn)高效的分離。...

這兩種層析都基于蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)，但應(yīng)用條件和劇烈程度不同。HIC在生理?xiàng)l件或高鹽濃度下進(jìn)行，高鹽濃度增強(qiáng)了蛋白質(zhì)表面的疏水相互作用，使其與固定相上溫和的疏水基團(tuán)（如苯基、丁基）結(jié)合。隨后通過(guò)降低鹽濃度的梯度進(jìn)行洗脫。HIC非常適用于在離子交換后緊接著進(jìn)行，因...

在工業(yè)生產(chǎn)和大型研究項(xiàng)目中，純化成本是需要嚴(yán)格考量的因素。成本包括層析介質(zhì)（其壽命和載量）、緩沖液、設(shè)備折舊、人力及時(shí)間。一個(gè)高質(zhì)量的純化流程不僅追求高純度，還需在成本、時(shí)間和收率之間取得比較好平衡，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)可行的規(guī)?；a(chǎn)。未來(lái)蛋白質(zhì)純化技術(shù)的發(fā)展將聚焦于更...

動(dòng)態(tài)光散射是一種快速、無(wú)損的技術(shù)，用于測(cè)量溶液中蛋白質(zhì)或納米顆粒的流體力學(xué)半徑分布。在蛋白質(zhì)純化中，DLS主要用于：1）評(píng)估樣品的單分散性，一個(gè)狹窄的峰表明樣品均一，是結(jié)晶和結(jié)構(gòu)研究的理想狀態(tài)；一個(gè)寬峰或多個(gè)峰則表明存在聚合體或降解產(chǎn)物；2）監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性...

連續(xù)層析是生物制藥下游工藝的新趨勢(shì)，它通過(guò)多柱切換技術(shù)，使層析過(guò)程在不同階段（如上樣、洗淋、洗脫、再生）同時(shí)進(jìn)行，提高了介質(zhì)利用率和生產(chǎn)效率，減少了設(shè)備占地面積和緩沖液消耗。這種模式在抗體的大規(guī)模生產(chǎn)中正展現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，面對(duì)細(xì)胞...

雖然電泳（如SDS-PAGE， 等電聚焦， 天然PAGE）主要用于分析，但它們也可用于小規(guī)模的制備或特殊用途的純化。制備型電泳可以在非變性條件下分離蛋白質(zhì)，用于后續(xù)的活性研究或抗原制備。電洗脫是從凝膠切片中回收蛋白質(zhì)的常用方法。更高級(jí)的系統(tǒng)，如制備型等電聚焦或...

緩沖液的選擇對(duì)蛋白純化至關(guān)重要，不同純化步驟需使用不同類型的緩沖液。粗提階段常用Tris-HCl緩沖液，因其緩沖范圍廣（pH 7.0-9.0）且對(duì)蛋白活性影響??；離子交換層析需根據(jù)樹脂類型選擇緩沖液，陽(yáng)離子交換常用醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.0-6.0），陰...

緩沖液是蛋白質(zhì)純化的“血液”，其選擇對(duì)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、活性和分離效果至關(guān)重要。一個(gè)理想的緩沖系統(tǒng)需要考慮以下因素：1）緩沖試劑的選擇，其pKa值應(yīng)在目標(biāo)pH值的±1范圍內(nèi)，且不與目標(biāo)蛋白或樹脂發(fā)生相互作用（如磷酸鹽會(huì)與Ca2?沉淀，Tris在某些酶反應(yīng)中是抑...

連續(xù)層析是生物制藥下游工藝的新趨勢(shì)，它通過(guò)多柱切換技術(shù)，使層析過(guò)程在不同階段（如上樣、洗淋、洗脫、再生）同時(shí)進(jìn)行，提高了介質(zhì)利用率和生產(chǎn)效率，減少了設(shè)備占地面積和緩沖液消耗。這種模式在抗體的大規(guī)模生產(chǎn)中正展現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，面對(duì)細(xì)胞...

尺寸排阻層析，也稱為凝膠過(guò)濾，是根據(jù)蛋白質(zhì)流體力學(xué)體積（或表觀分子量）進(jìn)行分離的獨(dú)特方法。其固定相是由高度多孔的惰性顆粒組成。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過(guò)層析柱時(shí)，大于孔徑的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入顆粒內(nèi)部，只能從顆粒間的空隙流過(guò)，因而較早被洗脫。較小的蛋白質(zhì)可以進(jìn)入部分或全部孔...

除非純化的是胞外分泌的蛋白質(zhì)，否則第一步通常是從細(xì)胞或組織中釋放出目標(biāo)蛋白。細(xì)胞破碎的方法需根據(jù)樣本類型選擇。對(duì)于細(xì)菌，常用超聲破碎、高壓勻質(zhì)（如French Press）或酶解法（如溶菌酶處理）。對(duì)于培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常采用溫和的 detergent 裂...

在大腸桿菌等系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白時(shí)，一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題是目標(biāo)蛋白可能以不溶性的、無(wú)活性的聚集體的形式表達(dá)，稱為“包涵體”。雖然這帶來(lái)了挑戰(zhàn)，但包涵體通常很純凈，且能抵抗蛋白酶降解。純化包涵體蛋白的策略與可溶性蛋白截然不同。首先需要通過(guò)超聲破碎細(xì)胞，然后通過(guò)離心收集包...

在離心之后，上清液可能仍含有細(xì)微的懸浮顆粒和脂質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)堵塞后續(xù)的層析柱，明顯降低純化效率。深層過(guò)濾作為一種補(bǔ)充的澄清手段，利用由纖維素、硅藻土等組成的具有深度效應(yīng)的濾膜，通過(guò)機(jī)械截留和吸附作用捕獲這些微小顆粒。此步驟能有效保護(hù)下游層析系統(tǒng)，延長(zhǎng)柱壽命，提...