浙江重組蛋白內(nèi)毒素檢測(cè)操作步驟

來源： 發(fā)布時(shí)間：2025-10-06

針對(duì)單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定法（MAT）通過檢測(cè)內(nèi)毒素的生物活性，有效規(guī)避低內(nèi)毒素回收（LER）對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)的影響。其原理是：熱原（包括被掩蔽的 LPS）活化單核細(xì)胞表面的 TLR 受體，釋放 IL-6 等細(xì)胞因子，通過 ELISA 檢測(cè) IL-6 濃度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線推算熱原含量。即使 LPS 因 LER 改變超分子結(jié)構(gòu)，只要仍具生物活性，就能被 MAT 法識(shí)別。這種 “檢測(cè)活性而非結(jié)構(gòu)” 的特性，使 MAT 法成為 LER 場(chǎng)景下內(nèi)毒素檢測(cè)的重要補(bǔ)充，與其他方法協(xié)同構(gòu)建高效可靠的熱原防控體系。
鱟試劑含多種酶和輔助因子，批次間活性差異可能導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果變異性。浙江重組蛋白內(nèi)毒素檢測(cè)操作步驟

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如何準(zhǔn)備樣品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)呢？測(cè)試前，需要根據(jù)樣品實(shí)際情況進(jìn)行樣本前處理。大多數(shù)樣品只需要稀釋，使用內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試即可。如果樣品有蛋白酶干擾并導(dǎo)致假陽性結(jié)果，建議對(duì)樣品稀釋并70°C加熱5-15分鐘進(jìn)行熱滅活處理。如需要，可以對(duì)滅活樣品進(jìn)行進(jìn)一步稀釋后檢測(cè)。如果樣品可能含有受β-葡聚糖，建議使用抗增液。β-葡聚糖可能來自酵母和纖維素材料。如果樣品中因含有內(nèi)毒素結(jié)合物而存在抑制，可以嘗試使用分散劑。
江蘇抗體藥物內(nèi)毒素檢測(cè)法規(guī)要求在醫(yī)藥、生物制品及醫(yī)療器械等諸多領(lǐng)域，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)是保障產(chǎn)品質(zhì)量與安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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β- 葡聚糖是鱟試劑（LAL）檢測(cè)內(nèi)毒素的常見干擾物，可活化 LAL 中的 G 因子通路，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。干擾多見于含植物源原料的樣品（如中藥注射劑）、生物發(fā)酵產(chǎn)物或環(huán)境真菌污染的樣品。消除方法包括：使用特異性 LAL 試劑（如添加葡聚糖抑制劑的 LAL），其只對(duì)內(nèi)毒素敏感而不受 β- 葡聚糖影響；采用加熱處理（如 80℃加熱 10 分鐘）破壞 β- 葡聚糖結(jié)構(gòu)；或通過親和層析去除樣品中的 β- 葡聚糖。檢測(cè)時(shí)需設(shè)置 β- 葡聚糖陽性對(duì)照，若對(duì)照反應(yīng)陽性而內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品無反應(yīng)，表明存在干擾，需優(yōu)化前處理步驟后重新檢測(cè)。

內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑的反應(yīng)受pH的干擾。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，要調(diào)節(jié)被測(cè)溶液的pH值，使鱟試劑與供試品溶液的混合溶液pH值落在鱟試劑指定的使用pH范圍內(nèi)（一般鱟試劑作用pH值在6.0~8.0范圍內(nèi))。用于調(diào)節(jié)pH值的試液或溶液（酸或堿)，可采用BET用水配制，并將溶液在無熱原容器中儲(chǔ)存；必須對(duì)試液或溶液進(jìn)行驗(yàn)證，以證明不含可檢出的內(nèi)毒素并且無干擾因素。調(diào)節(jié)pH試劑（酸或堿）的添加量，不應(yīng)該超過供試品的1092。如果超過10%，則在進(jìn)行計(jì)算時(shí)，將DH試劑的添加量的系數(shù)計(jì)算進(jìn)去。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有凝膠法和光度測(cè)定法，結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除規(guī)定外以凝膠限度試驗(yàn)為準(zhǔn)。

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樣品中的高滲透性成分（如高濃度鹽、糖）會(huì)通過改變反應(yīng)體系滲透壓，抑制鱟試劑反應(yīng)，影響內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果。例如，濃度為 70% 的葡萄糖溶液、高濃度氯化鈉溶液等，會(huì)形成高滲透壓環(huán)境，導(dǎo)致鱟試劑中的蛋白質(zhì)脫水變性，喪失酶活性，進(jìn)而使內(nèi)毒素?zé)o法被正常檢測(cè)，出現(xiàn)假陰性。這類高滲透性基質(zhì)的干擾機(jī)制明確 —— 通過破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響酶促反應(yīng)，且干擾程度與濃度正相關(guān)。為消除這類干擾，解決方案是使用內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品：根據(jù)樣品滲透性高低，逐步稀釋至適宜濃度（通常需稀釋至滲透壓與生理鹽水接近），降低對(duì)蛋白質(zhì)的脫水作用，恢復(fù)鱟試劑中酶的活性。稀釋過程中需注意，稀釋倍數(shù)需在方法驗(yàn)證確定的 “無干擾稀釋范圍” 內(nèi)，避免因過度稀釋導(dǎo)致內(nèi)毒素濃度低于檢測(cè)限，確保內(nèi)毒素檢測(cè)既能規(guī)避高滲透性抑制，又能準(zhǔn)確捕捉微量?jī)?nèi)毒素。
重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）抗干擾能力強(qiáng)于重組 C 因子（rFC），適配高蛋白、疫苗等復(fù)雜樣本檢測(cè)。浙江血液制品內(nèi)毒素檢測(cè)重組級(jí)聯(lián)試劑（rCR）

天然鱟試劑依賴鱟血，資源短缺，重組試劑成內(nèi)毒素檢測(cè)未來趨勢(shì)。浙江重組蛋白內(nèi)毒素檢測(cè)操作步驟

在為新物料或新產(chǎn)品、中間產(chǎn)品建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法時(shí)，常會(huì)遇到各種困難，尤其是尚處于新藥研發(fā)早期階段的藥物。此時(shí)，由于藥物制劑、緩沖系統(tǒng)等還不穩(wěn)定，經(jīng)常會(huì)發(fā)生變化，這樣就給方法的建立帶來了不同程度的影響。在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之前，須盡可能多地了解有關(guān)該藥品的基本信息，例如：有關(guān)樣品的可溶性信息、推薦的稀釋液、在水中的溶解度以及合適溶劑，樣品的pH范圍，分子量大小；如果是蛋白產(chǎn)品，還要了解該產(chǎn)品的等電點(diǎn)，產(chǎn)品規(guī)格、體積或重量，擬用于臨床的用法和用量等，以便選擇合適的樣品處理方法和內(nèi)毒素檢測(cè)方法。
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