上海通用型宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)免疫策略

湖州申科生物依據(jù)不同宿主的實(shí)際生產(chǎn)工藝，借助高質(zhì)量免疫原與HCP多抗的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，制備出高效價(jià)、高覆蓋率的抗體，進(jìn)而開發(fā)出SHENTEK^®HCP檢測(cè)試劑盒：適配大腸桿菌表達(dá)菌（BL21）生產(chǎn)工藝及克隆菌堿裂法提取質(zhì)粒工藝，以及適配CHO、MDCK、HEK293、Sf9、VERO、畢赤酵母等不同宿主，可用于中間品、原液及終產(chǎn)品的HCP定量監(jiān)測(cè)。為保障ELISA法對(duì)HCP定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，需對(duì)HCP抗體覆蓋率開展驗(yàn)證。湖州申科的抗體覆蓋率平臺(tái)，采用2D Clean-up試劑盒去除蛋白樣品中的干擾物（如洗滌劑、鹽、脂質(zhì)、酚類、核酸等離子污染物），同時(shí)設(shè)置2D質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施嚴(yán)格質(zhì)控，并以陰性抗體作為對(duì)照開展平行試驗(yàn)，以此提升結(jié)果準(zhǔn)確度。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）多與細(xì)胞關(guān)鍵功能相關(guān)，像細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活及凋亡等，工藝過(guò)程中會(huì)通過(guò)細(xì)胞分泌，或因細(xì)胞死亡、裂解而釋放。生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，主要有三方面因素影響HCP的組成與豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下潛在HCP數(shù)量可能極多，且并非所有基因都會(huì)表達(dá)，部分基因的表達(dá)存在時(shí)間與條件差異；例如大腸桿菌約含4300個(gè)基因，不同工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，增加HCP的總數(shù)與生化復(fù)雜性。研究表明，大腸桿菌表達(dá)的蛋白存在數(shù)量差異，這可能是對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但85-90%有潛在免疫原性的HCP在不同發(fā)酵過(guò)程中均會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體及輔助成分構(gòu)成的體系，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、瞬時(shí)及誘導(dǎo)表達(dá)；以大腸桿菌為例，常見的表達(dá)形式包括胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性包涵體形式，以及融合與非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品自身特性：純化過(guò)程中能去除99%以上的HCP，但仍有殘留HCP保留在產(chǎn)品中，這些殘留HCP可能與產(chǎn)品結(jié)合，隨產(chǎn)品一同完成純化。

湖州申科生物參照 USP 通則 <1132.1> 的相關(guān)內(nèi)容，憑借公司在生物制品質(zhì)量控制領(lǐng)域十余年的深耕經(jīng)驗(yàn)，對(duì) LC-MS 檢測(cè) HCPs 的方法開展評(píng)價(jià)與優(yōu)化。同時(shí)通過(guò)為 LC-MS 檢測(cè) HCPs 的整體流程構(gòu)建完整質(zhì)控體系，建立起一套抗干擾能力強(qiáng)、穩(wěn)定性佳、準(zhǔn)確度高且結(jié)果真實(shí)可靠的 LC-MS 檢測(cè) HCPs 標(biāo)準(zhǔn)方法。該檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)包含樣品制備、質(zhì)譜檢測(cè)、數(shù)據(jù)生信分析及質(zhì)譜結(jié)果方法驗(yàn)證四個(gè)部分，目前利用該 LC-MS 平臺(tái)已完成對(duì) 293T、不同工藝大腸桿菌（E.coli）、CHO、Vero、MDCK、Sf9 等不同工程細(xì)胞 HCPs 抗體覆蓋率的檢測(cè)分析。

樣品質(zhì)量是影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一。HCP 檢測(cè)覆蓋生物制品生產(chǎn)全流程，包含收獲、純化、制備等多個(gè)環(huán)節(jié)，不同樣品基質(zhì)會(huì)導(dǎo)致 HCP 檢測(cè)結(jié)果存在明顯差異。以含佐劑的疫苗為例，佐劑會(huì)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致成品中難以檢測(cè) HCP，因此通常在吸附工藝前的原液階段開展檢測(cè)。此外，樣品的收集、處理及保存方式也對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響。處理方式不當(dāng)可能造成蛋白降解或變性，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。比如將歷史批樣品用作內(nèi)部質(zhì)控品時(shí)，需結(jié)合其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，合理設(shè)定保存條件與保存期限，以此保障檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

湖州申科生物CHO-K1HCP殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），采用固相酶聯(lián)免疫吸附法原理，可對(duì)CHO-K1細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品中宿主殘留蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，向預(yù)包被抗CHO-K1HCPs綿羊多抗的酶標(biāo)板中，加入校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品、HRP標(biāo)記的抗CHO-K1HCPs綿羊多抗共同孵育。洗滌后加入TMB底物顯色，隨后用終止液終止酶促反應(yīng)；再用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，該吸光度與校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品中HCPs濃度呈正相關(guān)，依據(jù)校準(zhǔn)品擬合的劑量-反應(yīng)曲線，即可算出待測(cè)樣品中HCPs的濃度。該試劑盒對(duì)待測(cè)樣品無(wú)需特殊處理，通過(guò)合適稀釋比例的適用性驗(yàn)證，即可直接使用。且試劑盒操作步驟少、檢測(cè)快速，同時(shí)具備專一性強(qiáng)、性能穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。

在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)方面，工藝特異型檢測(cè)試劑盒（upstream-process）專門針對(duì)特定生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)，其關(guān)鍵特征是依托產(chǎn)物的實(shí)際宿主細(xì)胞開展開發(fā)及驗(yàn)證，通過(guò)模擬真實(shí)生產(chǎn)流程制備廣譜 HCP 抗原，且要求抗血清具備高覆蓋率以適配工藝變動(dòng)，從而保障對(duì)特定生產(chǎn)流程中 HCP 殘留的高度準(zhǔn)確監(jiān)控。平臺(tái)型檢測(cè)試劑盒（platform）則由生產(chǎn)商圍繞特定表達(dá)宿主細(xì)胞及相近工藝自主開發(fā)，優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在能借助相同參考標(biāo)準(zhǔn)品與試劑，統(tǒng)一監(jiān)測(cè)基于該宿主細(xì)胞生產(chǎn)的不同產(chǎn)品，適用于上游工藝足夠相似的產(chǎn)品線。通用型檢測(cè)試劑盒（commercial）屬于市售廣譜檢測(cè)方案，適合相似宿主細(xì)胞的常規(guī) HCP 檢測(cè)；但由于其制備過(guò)程未必能完全模擬目標(biāo)產(chǎn)物的實(shí)際生產(chǎn)場(chǎng)景，因此需嚴(yán)格評(píng)估多克隆抗體對(duì)特定產(chǎn)品 HCP 的覆蓋率，以此確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。這三類試劑盒覆蓋了從深度定制到通用篩查的各類 HCP 檢測(cè)需求。