北京熱原檢測(cè)法規(guī)要求

來(lái)源： 發(fā)布時(shí)間：2025-11-13

中國(guó)藥典對(duì) MAT 法熱原檢測(cè)要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過(guò)嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測(cè)重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長(zhǎng)期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過(guò)程檢測(cè)（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測(cè)，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對(duì)于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測(cè)值偏離平均值 30% 以上，且無(wú)明顯操作誤差（如加樣錯(cuò)誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說(shuō)明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。
歐洲藥典已正式廢除家兔法熱原檢測(cè)，推薦單核細(xì)胞活化反應(yīng)試驗(yàn)（MAT）為合適的替代方案。北京熱原檢測(cè)法規(guī)要求

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熱原是指微量即可引發(fā)恒溫動(dòng)物體溫異常升高的物質(zhì)，分為內(nèi)源性（如細(xì)胞因子）與外源性兩類，外源性熱原又涵蓋微生物來(lái)源（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS、革蘭氏陽(yáng)性菌脂磷壁酸 LTA、病毒、真菌等）與非微生物來(lái)源（灰塵、橡膠降解產(chǎn)物等）。傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測(cè)革蘭氏陰性菌的 LPS，無(wú)法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩鴨魏思?xì)胞活化試驗(yàn)（MAT）可彌補(bǔ)這一缺陷。其原理是：熱原通過(guò)活化單核細(xì)胞表面的 Toll 樣受體（TLR，如 TLR4 識(shí)別 LPS、TLR2/TLR6 識(shí)別 LTA），啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)，促使細(xì)胞釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子；隨后采用 ELISA 法檢測(cè) IL-6 濃度，結(jié)合 LPS 標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中總熱原含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩耐綑z測(cè)，契合《中國(guó)藥典》9301 指導(dǎo)原則中 全場(chǎng)景防控?zé)嵩L(fēng)險(xiǎn)”的要求。
上海醫(yī)療器械熱原檢測(cè)中國(guó)藥典9301已將MAT列為熱原檢測(cè)的補(bǔ)充方法，美國(guó)藥典鼓勵(lì)企業(yè)采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的MAT替代家兔法。

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湖州申科生物熱原檢測(cè)（MAT法） 試劑盒在靈敏度、穩(wěn)定性與適用性上表現(xiàn)突出，關(guān)鍵性能參數(shù)符合藥典要求：標(biāo)曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，相關(guān)系數(shù) R2≥0.98，定量限 0.025EU/mL，檢測(cè)限（LOD）0.0125EU/mL，批間精密度 CV≤25%，可準(zhǔn)確捕捉微量熱原。其優(yōu)勢(shì)在于特定的單核細(xì)胞系 —— 與依賴供體血液的 PBMC 細(xì)胞不同，申科 MAT 細(xì)胞系來(lái)源清晰可溯源，無(wú)需倫理審批與血站合作，規(guī)避供體差異導(dǎo)致的檢測(cè)波動(dòng)。對(duì)比同類型產(chǎn)品（如國(guó)外廠家 PBMC 細(xì)胞），申科細(xì)胞系的標(biāo)曲各濃度點(diǎn) CV 更低（ 低至3.6%）、相對(duì)偏差更?。?nbsp;12.31%），線性 R2 達(dá) 1.000，穩(wěn)定性更優(yōu)。此外，細(xì)胞凍存液組分經(jīng)優(yōu)化，復(fù)蘇后活率高，無(wú)需額外調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)即可直接與供試品共孵育，操作便捷；且適配任何具備 450nm 波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，無(wú)需專門的設(shè)備，降低實(shí)驗(yàn)室投入成本。

MAT法（單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定）熱原檢測(cè)基于人體免疫反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)，原理是：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌來(lái)源）與非內(nèi)毒素?zé)嵩ǜ锾m氏陽(yáng)性菌、霉菌、病毒等來(lái)源）進(jìn)入人體后，會(huì)活化單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子。檢測(cè)時(shí)將供試品與單核細(xì)胞 / 單核細(xì)胞系共孵育，再通過(guò) ELISA 定量檢測(cè)釋放的 IL-6 含量，結(jié)合內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩娜采w檢測(cè)。
MAT 法檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌注射劑，需排查非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ?LTA），避免只測(cè)內(nèi)毒素漏檢。

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基于單核細(xì)胞系的穩(wěn)定性，MAT 熱原檢測(cè)可將復(fù)孔數(shù)從藥典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®熱原檢測(cè)試劑盒數(shù)據(jù)顯示，單核細(xì)胞系標(biāo)曲的 4 復(fù)孔與 3 復(fù)孔，各濃度點(diǎn)（0.0125-1.0EU/mL）的準(zhǔn)確度（相對(duì)偏差）與精密度均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，無(wú)明顯差異。這一調(diào)整的主要依據(jù)是單核細(xì)胞系消除了 PBMC 的異質(zhì)性，無(wú)需依賴多復(fù)孔抵消波動(dòng)，既能滿足熱原檢測(cè)的穩(wěn)定性與統(tǒng)計(jì)學(xué)合理性要求，又能減少試劑與耗材消耗，降低檢測(cè)成本，同時(shí)提升實(shí)驗(yàn)效率。因此樣品預(yù)測(cè)試時(shí)可選擇3復(fù)孔進(jìn)行初步檢測(cè)，產(chǎn)品放行還需按照藥典要求進(jìn)行4復(fù)孔測(cè)試。
研究建立體外熱原檢測(cè)替代方法以替代家兔法，符合3R理論，是熱原檢測(cè)國(guó)際趨勢(shì)，受各國(guó)藥監(jiān)機(jī)構(gòu)重視。上海醫(yī)療器械熱原檢測(cè)

熱原檢測(cè)MAT法可在96孔板中批量檢測(cè)，單批次實(shí)驗(yàn)1.5天即可放行，家兔法需3-7天。北京熱原檢測(cè)法規(guī)要求

MAT 法熱原檢測(cè)標(biāo)曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優(yōu)勢(shì)在于提升標(biāo)曲準(zhǔn)確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關(guān)鍵濃度區(qū)間：熱原檢測(cè)的重點(diǎn)關(guān)注區(qū)為低濃度拐點(diǎn)（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺(tái)區(qū)（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區(qū)間設(shè)置更多濃度點(diǎn)（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點(diǎn)少，易導(dǎo)致低濃度熱原定量不準(zhǔn)。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續(xù)稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會(huì)累積，導(dǎo)致低濃度點(diǎn)實(shí)際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過(guò)單獨(dú)配制每個(gè)濃度點(diǎn)（如直接用標(biāo)準(zhǔn)品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標(biāo)曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據(jù)樣品預(yù)期濃度調(diào)整標(biāo)曲范圍，如樣品預(yù)期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點(diǎn)，確保樣品濃度落在標(biāo)曲線性區(qū)，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優(yōu)勢(shì)使非倍比稀釋成為 MAT 法標(biāo)曲配制的優(yōu)先選擇方式。
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