上海單抗藥物用宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測抗體覆蓋率驗(yàn)證

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）的來源中，常伴隨核酸、胞膜脂類及培養(yǎng)基中的氨基酸等非HCP成分，這些成分會(huì)干擾總蛋白檢測的準(zhǔn)確性，因此在檢測前需開展純化前處理，同時(shí)對(duì)總蛋白檢測方法實(shí)施方法學(xué)確認(rèn)。HCP本身屬于多蛋白混合物，不同總蛋白定量方法的檢測結(jié)果會(huì)存在一定差異，這也是造成HCP免疫檢測方法結(jié)果不一致的原因之一。若不同HCP蛋白定量方法的檢測結(jié)果差異較大，通常需同時(shí)采用2種及以上經(jīng)確認(rèn)的方法進(jìn)行檢測，隨后取平均值。總蛋白檢測方法的定量限通常只能達(dá)到μg/mL級(jí)別，而HCP檢測試劑盒的產(chǎn)品校準(zhǔn)品濃度則處于ng/mL級(jí)別。將HCP高濃度原液稀釋至低濃度產(chǎn)品校準(zhǔn)品的過程中會(huì)產(chǎn)生稀釋誤差，因此需對(duì)產(chǎn)品校準(zhǔn)品重新進(jìn)行標(biāo)定賦值。編輯分享用多種方法確認(rèn)檢測結(jié)果時(shí)，如何選擇合適的方法組合？總蛋白檢測定量限與HCP校準(zhǔn)品濃度差異大的原因是什么？有哪些方法可以降低非HCP成分對(duì)檢測的干擾？

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測中，抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)的操作難度較高，需在實(shí)驗(yàn)方法建立階段對(duì)關(guān)鍵步驟開展充分驗(yàn)證，以確保實(shí)驗(yàn)方法具備穩(wěn)健性。湖州申科研發(fā)的磁珠捕獲式 IMBS 技術(shù)（immunomagnetic beads separation，免疫磁珠分離），在開發(fā)過程中已對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分驗(yàn)證，相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果已通過專業(yè)評(píng)審，具體驗(yàn)證內(nèi)容（部分）如下：① 方法優(yōu)化：圍繞磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)開展優(yōu)化驗(yàn)證，確保方法穩(wěn)健性；② 過程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、時(shí)間跨度大、中間環(huán)節(jié)難把控等問題，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)引入熒光標(biāo)記多肽，可快速判定等電聚焦效果；同時(shí)在 SDS-PAGE 電泳兩側(cè)增設(shè) 40 ng 銀染質(zhì)控樣品，用于控制銀染顯色過程；③ 方法重復(fù)性：針對(duì) 2D 分析與 LC-MS 分析開展重復(fù)性驗(yàn)證，其中 2D 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 80% 以上，LC-MS 分析方法的重復(fù)性可達(dá) 90% 以上；④ 上樣量優(yōu)化：針對(duì) 2D 分析與 LC-MS 分析實(shí)施上樣量驗(yàn)證，規(guī)避上樣量差異對(duì)檢測結(jié)果的影響；⑤ 假陽性排查：排查樣品與陰性抗體間是否存在非特異性結(jié)合，確認(rèn) IMBS 實(shí)驗(yàn)設(shè)定的步驟與參數(shù)是否會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

大腸埃希氏菌（Escherichiacoli，簡稱E.coli，又稱大腸桿菌）作為模式微生物，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用較多。伴隨基因治療產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，它還成為質(zhì)粒DNA（pDNA）生產(chǎn)的主要宿主菌。質(zhì)粒樣品常規(guī)提取工藝中，常使用強(qiáng)堿性溶液進(jìn)行細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)變性，這種處理使其中的宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）與傳統(tǒng)物理破碎法得到的HCPs差異明顯，進(jìn)而導(dǎo)致采用免疫學(xué)原理的檢測方法時(shí)，殘留檢測結(jié)果偏差較大。湖州申科生物的E.coli克隆菌堿裂HCP殘留檢測試劑盒，適用于大腸埃希氏菌（即大腸桿菌）克隆菌株的HCPs檢測，涵蓋DH5α、Top10、JM109等常見菌株。該試劑盒的抗體制備過程中，采用堿裂工藝制備的HCPs免疫動(dòng)物，得到專屬抗體，可用于經(jīng)堿液裂解工藝處理后的宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）定量檢測。

法規(guī)推薦的抗體覆蓋率評(píng)估方法主要分為兩類：一類是傳統(tǒng) 2D-WB 法，另一類是基于抗體親和的免疫捕獲類方法。傳統(tǒng) 2D-WB 法存在諸多不足，如需對(duì)蛋白進(jìn)行變性處理、樣品需前處理（會(huì)破壞蛋白天然表位）、轉(zhuǎn)膜效率較低、易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)等，因此難以準(zhǔn)確反映真實(shí)的覆蓋率水平。湖州申科自主研發(fā)了免疫磁珠捕獲分離技術(shù)（immunomagnetic beads separation，IMBS），該技術(shù)借助免疫磁珠的半液態(tài)特性，能在懸浮狀態(tài)下與 HCP 樣本充分混勻并結(jié)合；整個(gè)過程中蛋白無需變性，且結(jié)合方式與 ELISA 檢測條件相近，從而可獲得更貼近真實(shí)情況的覆蓋率結(jié)果。

方法選擇是影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測結(jié)果的因素之一。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）與液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS），是當(dāng)前 HCP 檢測領(lǐng)域的兩類常用方法。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前在總 HCP 定量檢測中，ELISA 仍為主流技術(shù)；而 MS 法可用于特定蛋白（如高風(fēng)險(xiǎn)蛋白）的鑒定與定量，已成為重要的互補(bǔ)手段。此外，檢測過程中所用試劑與耗材的質(zhì)量，會(huì)直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。質(zhì)量不達(dá)標(biāo)的試劑，可能引發(fā)檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。舉例來說，若抗體的特異性與親和力不足，可能在 ELISA 檢測中產(chǎn)生交叉反應(yīng)；若抗原代表性不足或抗體覆蓋率偏低，則可能造成漏檢；而稀釋液抗干擾能力較弱時(shí)，也會(huì)對(duì)檢測準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。相關(guān)案例研究顯示，采用定制化方法替代原有商業(yè)化試劑盒后，抗原代表性與抗體覆蓋率明顯提升，HCP 檢測值也呈現(xiàn)整體升高的趨勢。

湖州申科生物在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA 檢測技術(shù)領(lǐng)域具備扎實(shí)的技術(shù)積累，已搭建起高質(zhì)量、全流程的自主開發(fā)平臺(tái)，覆蓋 HCP 檢測試劑盒研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①抗原表征與制備：依托合規(guī)平臺(tái)具備 HCP Reference/Antigen 制備能力，借助 2D 凝膠電泳等先進(jìn)技術(shù)保障抗原庫的代表性；②動(dòng)物免疫與抗體制備：憑借自有免疫動(dòng)物平臺(tái)，把控免疫原設(shè)計(jì)及動(dòng)物免疫過程，產(chǎn)出高特異性、廣覆蓋度的抗體；③體系開發(fā)與驗(yàn)證：依靠成熟技術(shù)經(jīng)驗(yàn)開發(fā)高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測體系，并嚴(yán)格遵循 GMP 標(biāo)準(zhǔn)完成方法學(xué)驗(yàn)證。該平臺(tái)通過全流程自主可控的技術(shù)整合，從源頭保障試劑盒性能的一致性與可靠性，大幅降低不同批次試劑盒的檢測變異性。其研發(fā)的 HCP ELISA 試劑盒已服務(wù)國內(nèi)外 200 余家生物醫(yī)藥企業(yè)，為單抗、疫苗等生物制品的工藝開發(fā)、質(zhì)量控制及 IND/BLA 等法規(guī)申報(bào)，提供符合監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)的定制化檢測方案。