江蘇非動物源熱原檢測規(guī)范

來源： 發(fā)布時間：2025-12-09

PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒依據(jù) ICH Q2 (R2)、《中國藥典》（如通則 9301）及歐洲藥典（EP 2.6.30）要求，完成了線性、范圍、定量限、準確度、精密度、耐用性等全維度性能驗證。線性方面，0.0125-1.0EU/mL范圍內擬合良好，R2≥0.98；準確度通過加標回收實驗驗證，不同樣品基質（如生物制品、化學制藥原料）的回收率均落在 50%-200% 區(qū)間；精密度表現(xiàn)優(yōu)異，批內與批間 CV 均≤15%，且無論是 3 復孔還是 4 復孔檢測均能達標。此外，試劑盒使用中國藥典推薦的 MAT 特定標準品，可直接用于國內外申報，契合全球 “3R 原則” 監(jiān)管導向—尤其適配《歐洲藥典》刪除家兔法、《美國藥典》鼓勵 MAT 替代等新法規(guī)趨勢，為企業(yè)應對不同地區(qū)的熱原檢測合規(guī)要求提供有力支持。
在藥品安全語境中，熱原特指細菌性熱原—微生物代謝產物、細菌尸體及內毒素的統(tǒng)稱。江蘇非動物源熱原檢測規(guī)范

江蘇非動物源熱原檢測規(guī)范,熱原檢測

在 MAT 法熱原檢測中，PBMC（外周血單核細胞）與單核細胞系各有優(yōu)劣，單核細胞系更適合標準化檢測。PBMC 的優(yōu)勢在于免疫細胞成分豐富（含單核細胞、淋巴細胞等），對熱原反應敏感，靈敏度相對較高；但局限同樣明顯 ——PBMC 需從不同供體獲取，供體免疫狀態(tài)差異會導致檢測結果不穩(wěn)定，且無法長期保存，難以建立標準化方法學。單核細胞系（如 HL-60、MM6、THP1）則克服了 PBMC 的局限：細胞來源穩(wěn)定（可批量培養(yǎng)），TLR 受體表達覆蓋主要亞型（如 HL-60 表達 TLR1-TLR9），對熱原反應重復性好，更適合商業(yè)化試劑盒與法規(guī)檢測。不同單核細胞系性能也有差異：MM6/IL-6 法檢測限約 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 為一級免疫效應物檢測限更低，但 TNF-α 穩(wěn)定性差；HL-60/IL-6 法檢測限與穩(wěn)定性均優(yōu)于前兩者，成為主流選擇。湖州申科生物MAT試劑盒選用 HL-60 細胞系，正是基于其優(yōu)異的穩(wěn)定性與熱原響應適配多場景，確保不同批次檢測結果一致。
上?；瘜W制藥熱原檢測操作步驟PBMC（外周血單個核細胞）用于 MAT 檢測時供體差異大，IL-6 釋放波動明顯，標準化難度高于單核細胞系。

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MAT法熱原檢測中，非內毒素熱原（NEP）對照品設為 “選做”，且試劑盒不默認配備，需結合檢測需求靈活使用，背后有明確的設置邏輯。首先，試劑盒開發(fā)階段已通過驗證（用多種 NEP 配體刺激細胞），證明其可檢出 NEP，后期實驗是否加入 NEP 對照，只需根據(jù)內部管理要求或專業(yè)人員建議確定，無需強制設置；若產品產線明確無 NEP 污染風險（如只使用革蘭氏陰性菌原料），可刪除 NEP 對照，簡化操作。其次，試劑盒不配備 NEP 對照品，是因不同用戶需求差異大 —— 部分用戶需檢測特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需檢測廣譜 NEP，因此提供單獨購買選項，用戶可按需選擇，避免資源浪費。NEP 對照品的主要使用場景包括：一是方法驗證階段，用于確認試劑盒對 NEP 的響應性；二是產品工藝變更后，排查是否引入 NEP 污染；三是歐盟申報時，需證明方法可覆蓋 NEP，此時需加入 NEP 對照品并顯示陽性結果。若樣品檢測中 NEP 對照品陽性，而樣品檢測陰性，可排除 NEP 污染；若樣品陽性，則需進一步鑒定熱原類型。

MAT法（單核細胞活化反應測定）熱原檢測基于人體免疫反應機制設計，原理是：內毒素（革蘭氏陰性菌來源）與非內毒素熱原（革蘭氏陽性菌、霉菌、病毒等來源）進入人體后，會活化單核細胞或單核細胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細胞因子。檢測時將供試品與單核細胞 / 單核細胞系共孵育，再通過 ELISA 定量檢測釋放的 IL-6 含量，結合內毒素標準品繪制的標曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實現(xiàn)內毒素與非內毒素熱原的全覆蓋檢測。
家兔法是熱原檢測 “金標準”，但操作繁瑣、耗時且需動物設施，存在明顯局限。

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傳統(tǒng)細菌內毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內毒素熱原，存在漏檢風險；同時，部分樣品（如脂質體、表面活性劑制劑）會因內毒素吸附導致低內毒素回收（LER），BET法難以準確定量。MAT 法通過單核細胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識別不同類型熱原：TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識別鞭毛蛋白、TLR3 識別病毒 dsRNA 等，實現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT法）的驗證數(shù)據(jù)顯示，其對不同濃度非內毒素熱原均有響應：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對應 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對應 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導致的假陰性，為CGT等高風險產品提供更有保障的熱原檢測方案。
選擇熱原檢測單核細胞活化反應測定法，即是選擇更準確、更安全、更可持續(xù)的檢測方案。上?？贵w藥物熱原檢測風險評估

熱原檢測MAT零動物消耗，降低檢測成本，提升檢測效率和倫理水平。江蘇非動物源熱原檢測規(guī)范

PyroSHENTEK®熱原檢測試劑盒突破傳統(tǒng)檢測方法局限，不僅能檢測革蘭氏陰性菌來源的內毒素，還可準確識別革蘭氏陽性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等產生的非內毒素熱原（NEP），契合熱原檢測 “全風險覆蓋” 的法規(guī)需求。其定量限低至 0.025EU/mL，實驗數(shù)據(jù)顯示，對 Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多種 NEP 均能有效檢出，且加標回收率穩(wěn)定在 50%-200% 合格范圍（如貝伐珠單抗注射液中 LTA 加標回收率 66.8%、Zysoman 加標回收率 113%）。此外，試劑盒聯(lián)合了國內相關機構完成室間驗證，與傳統(tǒng)家兔熱原試驗（RPT）橋接結果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 細胞）中 LPS 加標回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加標回收率 71.6%，檢測數(shù)據(jù)科學性符合國際法規(guī)要求，助力企業(yè)無縫銜接中美歐等地申報標準。
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