浙江合規(guī)性內(nèi)毒素檢測法規(guī)要求

《中國藥典》對內(nèi)毒素檢測提出了非常嚴(yán)格的要求，以確保藥品的質(zhì)量和安全性。湖州申科生物提供一系列高質(zhì)量的細菌內(nèi)毒素檢測產(chǎn)品，旨在為實驗室和工廠生產(chǎn)提供準(zhǔn)確、快速的檢測方案，產(chǎn)品涵蓋了凝膠法鱟試劑、動態(tài)顯色法鱟試劑、重組C因子法（rFC）和重組級聯(lián)試劑（rCR）、無熱原吸頭、內(nèi)毒素檢查用水、自動化設(shè)備、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)毒素指示劑等多種產(chǎn)品，滿足不同場景下的需求，同時可為復(fù)雜樣品基質(zhì)的內(nèi)毒素檢測提供解決方案。

重組級聯(lián)試劑作為內(nèi)毒素檢測鱟試劑的理想替代方案，其具備的優(yōu)勢有：①優(yōu)化的G因子級聯(lián)反應(yīng)，無G因子旁路干擾。采用基因重組技術(shù)表達鱟血細胞中的C因子（Factor C）、B因子（Factor B）和凝固酶原（Proclotting enzyme），無G因子旁路干擾，排除1，3-β-D葡聚糖假陽性風(fēng)險。②依然采用動態(tài)顯色法原理，可沿用天然鱟試劑檢測設(shè)備。重組級聯(lián)試劑（rCR）,與天然鱟（動態(tài)顯色法）具有相同的操作流程、檢測設(shè)備、分析方法，用戶可以沿用天然鱟的儀器、軟件、耗材、人員培訓(xùn)、驗收程序等，無需投入額外成本。③具有與天然鱟的相同反應(yīng)機制，檢測結(jié)果具有等效性。完全模擬了天然鱟試劑的酶聯(lián)反應(yīng)，由3種蛋白組成的級聯(lián)反應(yīng)機制提供了信號放大的過程，確保了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。湖州申科按照藥典要求進行替代方法驗證，無縫銜接技術(shù)轉(zhuǎn)移，助力用戶從方法驗證到工藝落地，從數(shù)據(jù)合規(guī)到全球申報。

內(nèi)毒素檢測的實驗方案需遵循“標(biāo)曲可靠性驗證（靈敏度復(fù)核）-稀釋倍數(shù)計算-干擾試驗”的完整流程，以保障檢測結(jié)果準(zhǔn)確合規(guī)。首先進行標(biāo)曲可靠性試驗，用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不超過10，下限濃度不低于鱟試劑標(biāo)示檢測限），每濃度設(shè) 3 支平行管，同時做2支陰性對照；當(dāng)陰性對照的吸光度小于或透光率大于標(biāo)準(zhǔn)曲線下限的檢測值或反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線下限的反應(yīng)時間，對數(shù)據(jù)進行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r的幅值≥0.980時試驗方有效，否則需重新操作。接著按公式 L=K/M 確定樣本內(nèi)毒素限值，K 值依給藥途徑而定，M結(jié)合人均60kg體重、1.62m2 體表面積及上限給藥劑量計算，也可參考藥典行標(biāo)。隨后明確有效稀釋上限倍數(shù)（MVD），即供試品允許稀釋的上限倍數(shù)，確保在此范圍內(nèi)檢測限值。再開展樣本干擾試驗，制備供試品溶液（A）、供試品加標(biāo)溶液（B，加標(biāo)濃度為標(biāo)曲中點）、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（C）及陰性對照（D），按公式 R=(Cs-Ct)/λm×100%計算加標(biāo)回收率，50%-200%為合格；若鱟試劑、生產(chǎn)工藝等發(fā)生變化，需重新進行干擾試驗，保障內(nèi)毒素檢測的可靠性。

湖州申科建立了標(biāo)準(zhǔn)化的低內(nèi)毒素回收（LER）技術(shù)服務(wù)流程，全周期支撐內(nèi)毒素檢測優(yōu)化：7 個自然日內(nèi)完成客戶溝通與 LER 確認，用天然鱟、重組鱟等方法檢測并出具報告；60 個自然日開展方法開發(fā)，分析 LER 成因（如螯合劑、蛋白質(zhì) IP）并研究去掩蔽方案；30 個自然日進行 HTS 驗證，完成 3 批 LER 實驗與干擾實驗，交付穩(wěn)定試劑盒、操作規(guī)程及培訓(xùn)；再協(xié)助方法轉(zhuǎn)移與 cGMP 驗證。流程每環(huán)節(jié)均圍繞內(nèi)毒素檢測展開，確保企業(yè)高效解決 LER 問題，滿足法規(guī)要求。

內(nèi)毒素檢測方法易受樣品基質(zhì)干擾，法規(guī)要求在方法應(yīng)用前必須進行干擾驗證，選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度，作為供試品干擾試驗種添加的內(nèi)毒素濃度計算回收率，若回收率在 50%-200% 范圍內(nèi)，表明無明顯干擾；若回收率異常，需通過過濾、中和、透析、加熱處理等方式優(yōu)化樣品前處理。方法學(xué)確認還需涵蓋線性范圍（如 0.005-5 EU/mL）、精密度（批內(nèi) CV≤15%）、檢測限（LOD≤0.01 EU/mL）等指標(biāo)，確保方法在實際樣品檢測中穩(wěn)定可靠，符合《美國藥典》 <85>、《中國藥典》通則 1143 等藥典要求。

當(dāng)實驗室更換內(nèi)毒素檢測方法或更換試劑供應(yīng)商時，需進行方法比對與橋接驗證。比對實驗需選取至少 3批代表性樣品，分別用新舊方法檢測，計算結(jié)果相關(guān)性（如相關(guān)系數(shù) R2≥0.95）和偏差（≤20%）。橋接驗證還需評估新方法的特異性、靈敏度是否與舊方法一致，如確認對高風(fēng)險樣品（如含 β- 葡聚糖的樣品）的抗干擾能力相當(dāng)。若方法變更涉及法規(guī)申報產(chǎn)品，需將驗證數(shù)據(jù)納入申報資料，證明變更后方法仍能有效控制內(nèi)毒素風(fēng)險，符合 FDA、NMPA 等監(jiān)管機構(gòu)對方法變更的合規(guī)性要求。