抗體藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證

來源： 發(fā)布時(shí)間：2025-12-10

PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）用于 MAT 熱原檢測(cè)時(shí)，存在異質(zhì)性與血源供應(yīng)兩大關(guān)鍵問題。從異質(zhì)性來看，PBMC 含 12% 單核細(xì)胞與 88% 淋巴細(xì)胞，且來自不同供體，細(xì)胞組成、功能狀態(tài)及熱原反應(yīng)存在明顯差異，導(dǎo)致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動(dòng)大，標(biāo)準(zhǔn)化難度高。血源供應(yīng)方面，除受獻(xiàn)血者數(shù)量、時(shí)間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴(yán)格檢測(cè)乙肝、丙肝等標(biāo)志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無(wú)菌操作，流程環(huán)節(jié)多、復(fù)雜度高，遠(yuǎn)不及單核細(xì)胞系制備簡(jiǎn)便，易影響熱原檢測(cè)的時(shí)效性與穩(wěn)定性。MAT 法干擾試驗(yàn)需設(shè) 3 個(gè)樣品濃度梯度（A、2A、4A 倍），均不超過MVD且加標(biāo)回收合格?？贵w藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證

抗體藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證,熱原檢測(cè)

熱原檢測(cè)MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國(guó)藥典認(rèn)可的熱原檢測(cè)替代方法。歐洲藥典（EP）是推動(dòng) MAT 應(yīng)用的關(guān)鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗(yàn)（RPT），且能同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?024 年歐洲藥典委員會(huì)批準(zhǔn)刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強(qiáng)制鼓勵(lì)使用 MAT 等體外替代方法。美國(guó)藥典（USP）<151> 規(guī)定，經(jīng)驗(yàn)證的體外熱原試驗(yàn)（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開展驗(yàn)證；FDA 行業(yè)指南進(jìn)一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國(guó)藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補(bǔ)充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)也優(yōu)先推薦體外熱原檢測(cè)模型，全球法規(guī)協(xié)同推動(dòng) MAT 成為熱原檢測(cè)的主流技術(shù)。
吉林生物制品熱原檢測(cè)PyroSHENTEK熱原檢測(cè)試劑盒采用“單核細(xì)胞+ELISA”標(biāo)準(zhǔn)化體系，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

抗體藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證,熱原檢測(cè)

在 MAT 法熱原檢測(cè)中，PBMC（外周血單核細(xì)胞）與單核細(xì)胞系各有優(yōu)劣，單核細(xì)胞系更適合標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。PBMC 的優(yōu)勢(shì)在于免疫細(xì)胞成分豐富（含單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等），對(duì)熱原反應(yīng)敏感，靈敏度相對(duì)較高；但局限同樣明顯 ——PBMC 需從不同供體獲取，供體免疫狀態(tài)差異會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，且無(wú)法長(zhǎng)期保存，難以建立標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)。單核細(xì)胞系（如 HL-60、MM6、THP1）則克服了 PBMC 的局限：細(xì)胞來源穩(wěn)定（可批量培養(yǎng)），TLR 受體表達(dá)覆蓋主要亞型（如 HL-60 表達(dá) TLR1-TLR9），對(duì)熱原反應(yīng)重復(fù)性好，更適合商業(yè)化試劑盒與法規(guī)檢測(cè)。不同單核細(xì)胞系性能也有差異：MM6/IL-6 法檢測(cè)限約 0.05EU/mL，THP1/TNF-α 法因 TNF-α 為一級(jí)免疫效應(yīng)物檢測(cè)限更低，但 TNF-α 穩(wěn)定性差；HL-60/IL-6 法檢測(cè)限與穩(wěn)定性均優(yōu)于前兩者，成為主流選擇。湖州申科生物MAT試劑盒選用 HL-60 細(xì)胞系，正是基于其優(yōu)異的穩(wěn)定性與熱原響應(yīng)適配多場(chǎng)景，確保不同批次檢測(cè)結(jié)果一致。

家兔熱原試驗(yàn)作為熱原檢測(cè)領(lǐng)域的 “法定傳統(tǒng)方法”，被中國(guó)藥典（ChP）、美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）均列為法定檢測(cè)項(xiàng)目，其主要優(yōu)勢(shì)在于可通過家兔體溫應(yīng)答篩查所有類型熱原，尤其適用于無(wú)法排除非內(nèi)毒素?zé)嵩廴镜母唢L(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品，如血液制品、放射性質(zhì)藥物及部分生物制劑。然而，家兔熱原試驗(yàn)存在明顯局限：動(dòng)物個(gè)體差異大，需額外投入時(shí)間與成本篩選合格家兔；檢測(cè)周期長(zhǎng)（至少 6 小時(shí)），無(wú)法滿足生物制品快速放行需求；靈敏度較低（對(duì) LPS 檢測(cè)限≥5EU/kg），與全球倡導(dǎo)的“動(dòng)物福利3R原則”背道而馳。
保持細(xì)胞活性穩(wěn)定，是實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確熱原檢測(cè)的基礎(chǔ)條件。

抗體藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證,熱原檢測(cè)

一次合格的 MAT 法熱原檢測(cè)，需同時(shí)滿足 “合格標(biāo)曲” 與 “合格樣品檢測(cè)值及回收率” 兩大關(guān)鍵條件。合格標(biāo)曲需具備四要素：一是良好線性，采用 4-Parameter Logistic 擬合，R2 需接近 1.0，避免線性不佳導(dǎo)致定量偏差；二是良好信號(hào)值，各濃度點(diǎn) OD 值需呈梯度變化，高濃度點(diǎn) OD 值需足夠（如上限濃度 OD600 達(dá) 1.0 左右），信號(hào)過低會(huì)影響靈敏度；三是良好 CV，復(fù)孔間 CV 需控制在合理范圍（定量限內(nèi)≤25%、定量上下限≤30%），確保重復(fù)性；四是良好背景值，陰性對(duì)照 OD 值需低于標(biāo)曲下限濃度點(diǎn) 10%，排除外源污染。合格樣品檢測(cè)值則需滿足加標(biāo)回收率在 50%-200%，例如文檔中某樣品 10 倍稀釋回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范圍內(nèi)調(diào)整稀釋倍數(shù)，同時(shí)樣品熱原濃度需低于規(guī)定限值（CLC），方可判定樣品符合要求。
MAT熱原檢測(cè)通過熱原活化單核細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，再經(jīng)ELISA定量 IL-6判斷供試品是否合格。抗體藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證

中國(guó)藥典規(guī)定 MAT 法標(biāo)曲需 4 個(gè)平行孔、濃度點(diǎn)≥4，推薦四參數(shù)擬合，r≥0.90?？贵w藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證

PyroSHENTEK®熱原檢測(cè)試劑盒（MAT法）已完成 25 個(gè)品種樣品的檢測(cè)驗(yàn)證，覆蓋單抗類、疫苗類、基因工程類、血液制品類、生化藥品類與注射液，結(jié)果顯示其適配性范圍廣但需關(guān)注部分樣品的干擾。疫苗類（如麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗、人用狂犬病疫苗）、基因工程類（重組人促紅素、干擾素 α-2b）、血液制品類（人血白蛋白、凝血因子 Ⅷ）與注射液（生理鹽水、琥珀酰明膠）的加標(biāo)回收率均在 50%-200% 范圍內(nèi)，無(wú)明顯干擾，檢測(cè)結(jié)果可靠。單抗類（如貝伐珠單抗、阿達(dá)木單抗）、中藥注射液等樣品雖存在不同程度的抑制作用，需通過提高稀釋倍數(shù)（如稀釋至 MVD 上限）、超聲處理或添加中和劑消除抑制，優(yōu)化后回收率均可達(dá)標(biāo)。此外，MAT 法可有效檢測(cè)非內(nèi)毒素?zé)嵩?，如?duì)貝伐珠單抗注射液中添加的酵母多糖（Zymosan，200μg/mL）、脂磷壁酸（LTA，10μg/mL），回收率分別達(dá) 113%、66.8%，證明其可解決傳統(tǒng)鱟試劑漏檢非內(nèi)毒素?zé)嵩膯栴}，尤其適用于高風(fēng)險(xiǎn)生物制品的熱原防控。
抗體藥物熱原檢測(cè)方法驗(yàn)證