上海重組蛋白內(nèi)毒素檢測法規(guī)要求

來源： 發(fā)布時間：2025-10-08

鱟試驗法（LAL 法）是細菌內(nèi)毒素檢測的經(jīng)典方法，依據(jù)反應監(jiān)測方式可分為三類：凝膠法、濁度法和顯色法。凝膠法通過觀察是否形成凝膠判斷內(nèi)毒素是否超標，其優(yōu)勢是操作簡便、成本較低，適用于定性或半定量檢測，如醫(yī)療器械初篩；濁度法通過監(jiān)測反應體系濁度變化速率定量內(nèi)毒素，靈敏度高（可達 0.005 EU/mL），適用于生物制品原液等高精度需求場景；顯色法基于顯色底物的吸光度變化定量，抗干擾能力較強，適配復雜基質(zhì)樣品（如含蛋白質(zhì)的注射液）。三種方法均需嚴格控制反應溫度（37℃±1℃）和時間，確保結(jié)果可靠性。
細菌內(nèi)毒素工作品若效價誤差或不穩(wěn)定，將影響實驗結(jié)果。上海重組蛋白內(nèi)毒素檢測法規(guī)要求

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低內(nèi)毒素回收（LER）又稱內(nèi)毒素掩蔽，是指無菌制劑（尤其蛋白類生物制劑）進行內(nèi)毒素檢測時，加標內(nèi)毒素的回收率＜50% 的現(xiàn)象，且無法通過稀釋排除，區(qū)別于傳統(tǒng)檢測干擾。LER 會導致內(nèi)毒素污染被低估，已被全球監(jiān)管機構(gòu)重點關(guān)注：FDA 2013 年要求生物藥 BLA 申報時提交 LER 研究報告；EMA 2023 年明確含表面活性劑（如吐溫）或螯合劑（如 EDTA）的制劑需提供 LER 數(shù)據(jù)；中國藥典 2025 版 9251 通則也新增 LER 內(nèi)容，與國際接軌。這些要求促使企業(yè)優(yōu)化內(nèi)毒素檢測流程，避免因 LER 導致的檢測偏差，確保藥品安全。
北京細菌內(nèi)毒素檢測抗干擾方案細菌內(nèi)毒素工作標準品可用于鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗，適配凝膠法與光度法實驗。

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內(nèi)毒素檢測方法易受樣品基質(zhì)干擾，法規(guī)要求在方法應用前必須進行干擾驗證，選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度，作為供試品干擾試驗種添加的內(nèi)毒素濃度計算回收率，若回收率在 50%-200% 范圍內(nèi)，表明無明顯干擾；若回收率異常，需通過過濾、中和、透析、加熱處理等方式優(yōu)化樣品前處理。方法學確認還需涵蓋線性范圍（如 0.005-5 EU/mL）、精密度（批內(nèi) CV≤15%）、檢測限（LOD≤0.01 EU/mL）等指標，確保方法在實際樣品檢測中穩(wěn)定可靠，符合《美國藥典》 <85>、《中國藥典》通則 1143 等藥典要求。

重組級聯(lián)試劑（rCR）通過完整模擬天然鱟試劑的酶促級聯(lián)反應路徑，實現(xiàn)高效且特異的內(nèi)毒素檢測。其反應機制為：內(nèi)毒素首先活化重組 C 因子，活化的 C 因子進一步活化重組 B 因子，隨后活化重組凝固酶原轉(zhuǎn)化為凝固酶，再催化顯色底物產(chǎn)生黃色信號（405nm 波長可檢測）。這一級聯(lián)放大過程有效提升了檢測靈敏度，即使微量內(nèi)毒素也能產(chǎn)生可識別信號。與單因子的重組 C 因子法（rFC）相比，rCR 的多因子級聯(lián)反應抗干擾能力更強，尤其對復雜基質(zhì)樣品（如高蛋白單抗、疫苗）表現(xiàn)更優(yōu)。同時，rCR 剔除了天然鱟試劑中的 G 因子，避免了與 β-D 葡聚糖的非特異性反應，從根本上減少假陽性結(jié)果，保障檢測數(shù)據(jù)的可靠性。
內(nèi)毒素工作標準品（CSE）稀釋液配制時渦旋很重要，可使內(nèi)毒素充分溶解，保證濃度準確。

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在進行內(nèi)毒素檢測時，干擾試驗又叫增強或抑制試驗，主要目的是確證檢測內(nèi)毒素的方法是否受樣品干擾。在建立細菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗證試驗前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準確可靠。藥典規(guī)定：①當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項品種建立內(nèi)毒素檢查法時，需進行干擾試驗；②當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變，或試驗環(huán)境下發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，需重新進行干擾試驗。生產(chǎn)廠家常發(fā)生的一些微小變更，會影響到評估結(jié)果，進而影響到供試品對鱟試劑的干擾試驗。因此，生產(chǎn)廠家應制定一個重復進行干擾試驗的周期，并進行跟蹤和記錄。
內(nèi)毒素檢查用水經(jīng)二次精制，無菌無熱原，避免檢測假陽假陰。江蘇抗體藥物內(nèi)毒素檢測結(jié)果判定

塑料器皿對內(nèi)毒素吸附力強，制備內(nèi)毒素工作標準品（CSE）稀釋液建議用硼硅酸鹽玻璃管。上海重組蛋白內(nèi)毒素檢測法規(guī)要求

實驗數(shù)據(jù)充分證明，內(nèi)毒素檢測重組級聯(lián)試劑（rCR）與天然鱟試劑的檢測結(jié)果具有高度等效性，可實現(xiàn)方法無縫切換。對細胞培養(yǎng)輔料、凍干甲型肝炎疫苗、單抗 A/B 等 8 類代表性樣品的平行檢測顯示，rCR 的檢測平均值為 0.001-0.026EU/mL，天然鱟試劑為 0.002-0.034EU/mL，兩者偏差≤0.003EU/mL。加標回收率方面，rCR 為 70%-175.4%，天然鱟試劑為 82.2%-156.6%，均處于 50%-200% 的合格范圍。批內(nèi)精密度上，rCR 的 CV 值為 0.524%-14.716%，天然鱟試劑為 0.908%-12.348%，均滿足法規(guī)對精密度的要求。這種等效性確保了實驗室在切換至重組試劑時，歷史數(shù)據(jù)和工藝控制標準的連續(xù)性，降低方法轉(zhuǎn)換風險。
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