江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

來源： 發(fā)布時間：2025-11-17

MAT法（單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定）熱原檢測基于人體免疫反應(yīng)機制設(shè)計，原理是：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌來源）與非內(nèi)毒素?zé)嵩ǜ锾m氏陽性菌、霉菌、病毒等來源）進入人體后，會活化單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子。檢測時將供試品與單核細(xì)胞 / 單核細(xì)胞系共孵育，再通過 ELISA 定量檢測釋放的 IL-6 含量，結(jié)合內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實現(xiàn)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩娜采w檢測。
湖州申科 MAT法熱原檢測試劑盒細(xì)胞復(fù)融后可直接使用，無需離心復(fù)蘇，24 小時內(nèi)出檢測結(jié)果。江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法,熱原檢測

MAT 法熱原檢測的穩(wěn)定性需從細(xì)胞、試劑、操作、樣品四維度嚴(yán)格把控。細(xì)胞層面，細(xì)胞活性與純度直接決定熱原響應(yīng)能力，活性不足會減少炎癥因子分泌，純度低則引入雜細(xì)胞干擾；細(xì)胞批次間一致性也關(guān)鍵，TLR 受體表達、倍增時間差異會導(dǎo)致結(jié)果波動。試劑與耗材方面，標(biāo)準(zhǔn)品效價需溯源國際標(biāo)準(zhǔn)，避免降解影響標(biāo)曲；試劑盒中細(xì)胞因子需質(zhì)控，防止外源熱原污染；培養(yǎng)液、緩沖液及無熱原耗材（吸頭、西林瓶）若熱原控制不當(dāng)，易引發(fā)假陽性。操作上，加樣手法要統(tǒng)一（如 8 通道移液器液面一致），孵育需 37℃、5% CO?穩(wěn)定環(huán)境，試劑配制濃度準(zhǔn)確，設(shè)備（酶標(biāo)儀、洗板機）定期校準(zhǔn)，操作偏差會直接導(dǎo)致異常。樣品層面，自身干擾物質(zhì)（消除炎癥成分、高鹽）、pH 偏離 6-8 或微生物污染，會抑制細(xì)胞活化或引入外源熱原，需針對性預(yù)處理。
北京熱原檢測操作步驟研究建立體外熱原檢測替代方法以替代家兔法，符合3R理論，是熱原檢測國際趨勢，受各國藥監(jiān)機構(gòu)重視。

江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法,熱原檢測

MAT 法熱原檢測標(biāo)曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優(yōu)勢在于提升標(biāo)曲準(zhǔn)確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關(guān)鍵濃度區(qū)間：熱原檢測的重點關(guān)注區(qū)為低濃度拐點（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺區(qū)（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區(qū)間設(shè)置更多濃度點（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點少，易導(dǎo)致低濃度熱原定量不準(zhǔn)。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續(xù)稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會累積，導(dǎo)致低濃度點實際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過單獨配制每個濃度點（如直接用標(biāo)準(zhǔn)品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標(biāo)曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據(jù)樣品預(yù)期濃度調(diào)整標(biāo)曲范圍，如樣品預(yù)期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點，確保樣品濃度落在標(biāo)曲線性區(qū)，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優(yōu)勢使非倍比稀釋成為 MAT 法標(biāo)曲配制的優(yōu)先選擇方式。

熱原是能引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)總稱，主要成分為細(xì)菌內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS），同時涵蓋病毒、真菌毒素、支原體等非內(nèi)毒素?zé)嵩?，其檢測是保障藥品與醫(yī)療器械安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)前熱原檢測已形成 “特異性檢測 + 廣譜篩查” 互補的完整體系：以鱟試驗法（含天然 LAL 與重組 rCR/rFC 試劑）作為細(xì)菌內(nèi)毒素的特異性檢測手段，憑借 fg 級靈敏度成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法，可通過凝膠法實現(xiàn)定性、動態(tài)濁度 / 顯色法完成定量；以家兔熱原試驗作為傳統(tǒng)廣譜篩查方法，雖操作繁瑣（需預(yù)試篩選基礎(chǔ)體溫穩(wěn)定家兔，正式試驗觀察 3 小時體溫變化），但仍是放射性質(zhì)的藥物、血液制品等高風(fēng)險產(chǎn)品排除非內(nèi)毒素?zé)嵩难a充手段；以單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）作為新興全熱原檢測技術(shù)，利用人源單核細(xì)胞（如 THP-1 細(xì)胞）釋放 IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的特性，可同時識別內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?，契合疫苗、基因治療產(chǎn)品等對風(fēng)險控制的需求。三種方法協(xié)同應(yīng)用，從原料入廠到成品放行構(gòu)建全流程熱原防控網(wǎng)絡(luò)，既保證對內(nèi)毒素的準(zhǔn)確監(jiān)控，又避免非內(nèi)毒素?zé)嵩倪z漏風(fēng)險。
家兔法是熱原檢測 “金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作繁瑣、耗時且需動物設(shè)施，存在明顯局限。

江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法,熱原檢測

MAT法熱原檢測特定標(biāo)準(zhǔn)品與傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品存在本質(zhì)差異，需明確區(qū)分以保障檢測準(zhǔn)確性。MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品為大腸桿菌（E.coli 0113:H10:K）菌株制備，經(jīng)全國 5 家藥品檢驗所（含中檢院）用凝膠法、動態(tài)濁度法及動態(tài)顯色法協(xié)作標(biāo)定，溯源至國際標(biāo)準(zhǔn)品，可同時檢測內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?；而傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（如 9000EU 規(guī)格）源自大腸桿菌（E.coli O111:B4），只適用于內(nèi)毒素檢測，無法識別非內(nèi)毒素?zé)嵩?。關(guān)鍵驗證數(shù)據(jù)顯示，用 MAT法檢測 9000EU 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品時，加標(biāo)回收率不在 50%-200% 的合格范圍，因此不能替代 MAT 特定標(biāo)準(zhǔn)品。值得注意的是，盡管 MAT 試劑盒用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)曲，但經(jīng)驗證其可識別非內(nèi)毒素?zé)嵩魳悠分写嬖诜莾?nèi)毒素?zé)嵩ㄈ绺锾m氏陽性菌的脂磷壁酸），會觸發(fā)細(xì)胞陽性反應(yīng)，有效避免漏檢，這也是 MAT 法在熱原防控中優(yōu)于單一內(nèi)毒素檢測的關(guān)鍵優(yōu)勢。
MAT 法干擾試驗需設(shè) 3 個樣品濃度梯度（A、2A、4A 倍），均不超過MVD且加標(biāo)回收合格。北京非動物源熱原檢測技術(shù)升級

熱原檢測歷經(jīng)動物整體試驗、體外生化反應(yīng)到細(xì)胞免疫應(yīng)答的三階段演進，靈敏度與效率不斷提升。江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法

PBMC（外周血單個核細(xì)胞）的復(fù)雜制備流程嚴(yán)重制約熱原檢測效率。首先，血源獲取受獻血者數(shù)量、時間及采集血液政策限制，無法按需即時獲?。黄浯?，需嚴(yán)格執(zhí)行 EP2.6.30 規(guī)定的標(biāo)志物檢測，增加前期準(zhǔn)備時間；再進行采集血液、分離單核細(xì)胞、凍存等環(huán)節(jié)需全程無菌操作，步驟繁瑣且易引入污染風(fēng)險。相比之下，單核細(xì)胞系可工業(yè)化培養(yǎng)，制備流程簡單可控，能快速提供合格細(xì)胞，避免因 PBMC 制備延誤熱原檢測進度，更適配批量樣品的高效質(zhì)控。江蘇化學(xué)制藥熱原檢測單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法