山東熱原檢測(cè)體系

基于單核細(xì)胞系的穩(wěn)定性，MAT 熱原檢測(cè)可將復(fù)孔數(shù)從藥典要求的≥4 降至≥3。PyroSHENTEK®熱原檢測(cè)試劑盒數(shù)據(jù)顯示，單核細(xì)胞系標(biāo)曲的 4 復(fù)孔與 3 復(fù)孔，各濃度點(diǎn)（0.0125-1.0EU/mL）的準(zhǔn)確度（相對(duì)偏差）與精密度均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，無(wú)明顯差異。這一調(diào)整的主要依據(jù)是單核細(xì)胞系消除了 PBMC 的異質(zhì)性，無(wú)需依賴(lài)多復(fù)孔抵消波動(dòng)，既能滿足熱原檢測(cè)的穩(wěn)定性與統(tǒng)計(jì)學(xué)合理性要求，又能減少試劑與耗材消耗，降低檢測(cè)成本，同時(shí)提升實(shí)驗(yàn)效率。因此樣品預(yù)測(cè)試時(shí)可選擇3復(fù)孔進(jìn)行初步檢測(cè)，產(chǎn)品放行還需按照藥典要求進(jìn)行4復(fù)孔測(cè)試。

PyroSHENTEK^®熱原檢測(cè)試劑盒以 “簡(jiǎn)化流程、提升效率” 為設(shè)計(jì)理念，采用即用型細(xì)胞，凍存細(xì)胞無(wú)需離心復(fù)蘇培養(yǎng)，復(fù)融后可直接與供試品混合共孵育，大幅節(jié)省傳統(tǒng)細(xì)胞預(yù)處理（如調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)、鋪板培養(yǎng)）的時(shí)間成本。實(shí)驗(yàn)流程清晰可控：只需按要求制備待測(cè)供試品與內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，各取對(duì)應(yīng)體積加入細(xì)胞懸液（每孔加樣量明確），經(jīng) 37℃、5% CO?孵育 24 小時(shí)后，離心收集上清并通過(guò) ELISA 法檢測(cè) IL-6 含量，全程可在 24 小時(shí)內(nèi)獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果。這種便捷性尤其適配實(shí)驗(yàn)室高通量檢測(cè)需求，減少人員操作步驟的同時(shí)，降低了因復(fù)雜操作引入的誤差風(fēng)險(xiǎn)，兼顧效率與準(zhǔn)確性。

MAT法（單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定）熱原檢測(cè)基于人體免疫反應(yīng)機(jī)制設(shè)計(jì)，原理是：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性菌來(lái)源）與非內(nèi)毒素?zé)嵩ǜ锾m氏陽(yáng)性菌、霉菌、病毒等來(lái)源）進(jìn)入人體后，會(huì)活化單核細(xì)胞或單核細(xì)胞系，使其釋放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子。檢測(cè)時(shí)將供試品與單核細(xì)胞 / 單核細(xì)胞系共孵育，再通過(guò) ELISA 定量檢測(cè)釋放的 IL-6 含量，結(jié)合內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)曲，即可判斷供試品中熱原含量是否符合規(guī)定，實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩娜采w檢測(cè)。

傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測(cè)革蘭氏陰性菌的 LPS，無(wú)法識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內(nèi)毒素?zé)嵩?，存在漏檢風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，部分樣品（如脂質(zhì)體、表面活性劑制劑）會(huì)因內(nèi)毒素吸附導(dǎo)致低內(nèi)毒素回收（LER），BET法難以準(zhǔn)確定量。MAT 法通過(guò)單核細(xì)胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識(shí)別不同類(lèi)型熱原：TLR4 識(shí)別 LPS、TLR2/TLR6 識(shí)別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識(shí)別鞭毛蛋白、TLR3 識(shí)別病毒 dsRNA 等，實(shí)現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測(cè)試劑盒（MAT法）的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，其對(duì)不同濃度非內(nèi)毒素?zé)嵩许憫?yīng)：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測(cè)到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對(duì)應(yīng) 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對(duì)應(yīng) 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測(cè)的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導(dǎo)致的假陰性，為CGT等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品提供更有保障的熱原檢測(cè)方案。

MAT 法熱原檢測(cè)背景值偏高會(huì)干擾結(jié)果判讀，需從試劑、操作兩方面解決。試劑相關(guān)問(wèn)題中，非特異性活化（如試劑含微量熱原）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常分泌 IL-6，需選用低內(nèi)毒素的試劑與耗材；檢測(cè)試劑添加過(guò)多（如抗體濃度過(guò)高）會(huì)增加非特異性結(jié)合，需按說(shuō)明書(shū)稀釋試劑或降低推薦濃度。操作環(huán)節(jié)問(wèn)題更多見(jiàn)：孔洗滌不充分會(huì)殘留未結(jié)合抗體與酶，需按方案完成規(guī)定洗滌次數(shù)（如 3-5 次），確保洗滌液充分浸潤(rùn)孔底；洗滌緩沖液污染（如滋生微生物）會(huì)引入外源信號(hào)，需現(xiàn)配現(xiàn)用緩沖液；加終止液后讀板延遲（超 10 分鐘），會(huì)因黃色產(chǎn)物降解導(dǎo)致背景虛高，需加終止液后立即讀板；底物孵育時(shí)見(jiàn)光會(huì)引發(fā)非特異性顯色，需在避光環(huán)境下進(jìn)行 TMB 孵育；孔板底部臟（如殘留指紋、液體痕跡）會(huì)影響光吸收，需用無(wú)塵紙清潔孔板底部后再讀板。通過(guò)以上措施，可有效降低背景值，確保檢測(cè)信號(hào)的真實(shí)性，避免因背景干擾導(dǎo)致熱原濃度誤判。

MAT 試劑盒配套的即用型細(xì)胞存在明確的傳代限制，且商業(yè)化傳代需獲得授權(quán)，關(guān)鍵是保障細(xì)胞質(zhì)量與檢測(cè)可靠性。首先，即用型細(xì)胞經(jīng)特殊工藝優(yōu)化，已處于較好的活性與熱原響應(yīng)狀態(tài)，不適合傳代，傳代后細(xì)胞會(huì)出現(xiàn) TLR 受體表達(dá)下降、炎癥因子分泌減少等問(wèn)題，導(dǎo)致熱原檢測(cè)靈敏度降低，如 HL-60 細(xì)胞傳代超過(guò) 5 代后，IL-6 分泌量下降 30%，無(wú)法滿足檢測(cè)要求。其次，若用戶(hù)需將即用型細(xì)胞用于商業(yè)化生產(chǎn)（如大規(guī)模檢測(cè)），需獲得湖州申科授權(quán)，包括用戶(hù)資質(zhì)審核、技術(shù)培訓(xùn)、傳代方案驗(yàn)證，確保用戶(hù)具備細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)量控制能力，避免未經(jīng)授權(quán)傳代導(dǎo)致細(xì)胞特性改變，影響檢測(cè)結(jié)果一致性。此外，參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，即使是可傳代的單核細(xì)胞系，使用代次也不超過(guò) 20 代，超過(guò)后代次細(xì)胞穩(wěn)定性差，因此即用型細(xì)胞設(shè)計(jì)為 “一次性使用”，從源頭避免傳代帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。用戶(hù)需嚴(yán)格遵守傳代限制，若需長(zhǎng)期使用，建議定期采購(gòu)新批次試劑盒，確保細(xì)胞質(zhì)量。