上海細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)操作步驟

湖州申科生物凝膠法鱟試劑憑借合規(guī)性和實(shí)用性，成為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)毒素定量檢測(cè)的優(yōu)先選擇。該產(chǎn)品嚴(yán)格符合 USP、EP、中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，提供 0.03、0.06、0.125、0.25、0.5EU/mL 等多種靈敏度規(guī)格，適配不同樣品的限值要求。設(shè)計(jì)上采用大瓶裝量（10 反應(yīng) / 支），減少瓶間差異和頻繁開瓶導(dǎo)致的污染風(fēng)險(xiǎn)，降低單位測(cè)試成本。針對(duì)血源制品、中藥注射劑等復(fù)雜基質(zhì)樣品，配套特異性抗增液（NND071）可高效抑制非特異性反應(yīng)，減少假陽(yáng)性結(jié)果。包裝選用易開啟西林瓶，避免操作時(shí)玻璃碎屑污染，提升使用安全性。憑借千家醫(yī)院的臨床使用經(jīng)驗(yàn)和穩(wěn)定的性能表現(xiàn)，該產(chǎn)品更適合血源制品及復(fù)雜基質(zhì)。

在開展內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，樣品的 pH 值與二價(jià)離子（Mg2?、Ca2?）水平是影響鱟試劑酶促反應(yīng)的關(guān)鍵因素，直接關(guān)系檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素依賴絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，該反應(yīng)的合適 pH 值范圍為 6.0-8.0，若樣品過(guò)酸或過(guò)堿，會(huì)快速降低酶活性，甚至導(dǎo)致酶徹底失活，進(jìn)而出現(xiàn)內(nèi)毒素檢測(cè)假陰性。針對(duì)這一問(wèn)題，可使用 0.1N 或更低濃度的 HCl/NaOH 溶液，將樣品 pH 值準(zhǔn)確調(diào)節(jié)至適宜區(qū)間，為反應(yīng)提供穩(wěn)定環(huán)境。同時(shí)，二價(jià)離子是反應(yīng)必需的輔助因子：Mg2?是內(nèi)毒素活化鱟試劑的關(guān)鍵，缺乏會(huì)直接阻斷反應(yīng)啟動(dòng)；Ca2?雖參與酶促反應(yīng)，但濃度過(guò)高會(huì)反向抑制反應(yīng)效率。若樣品中含有肝素鈉、EDTA、檸檬酸鈉等螯合劑，會(huì)與二價(jià)離子結(jié)合導(dǎo)致其濃度不足，此時(shí)可通過(guò)內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品降低螯合劑濃度，或添加特定二價(jià)離子試劑補(bǔ)充，但需嚴(yán)格控制離子濃度，避免過(guò)度增強(qiáng)反應(yīng)引發(fā)誤差，確保內(nèi)毒素檢測(cè)能真實(shí)反映樣品中的內(nèi)毒素殘留量。

在進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，干擾試驗(yàn)又叫增強(qiáng)或抑制試驗(yàn)，主要目的是確證檢測(cè)內(nèi)毒素的方法是否受樣品干擾。在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗(yàn)證試驗(yàn)前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準(zhǔn)確可靠。藥典規(guī)定：①當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，需進(jìn)行干擾試驗(yàn)；②當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變，或試驗(yàn)環(huán)境下發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，需重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。生產(chǎn)廠家常發(fā)生的一些微小變更，會(huì)影響到評(píng)估結(jié)果，進(jìn)而影響到供試品對(duì)鱟試劑的干擾試驗(yàn)。因此，生產(chǎn)廠家應(yīng)制定一個(gè)重復(fù)進(jìn)行干擾試驗(yàn)的周期，并進(jìn)行跟蹤和記錄。

針對(duì)單核細(xì)胞活化反應(yīng)測(cè)定法（MAT）通過(guò)檢測(cè)內(nèi)毒素的生物活性，有效規(guī)避低內(nèi)毒素回收（LER）對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)的影響。其原理是：熱原（包括被掩蔽的 LPS）活化單核細(xì)胞表面的 TLR 受體，釋放 IL-6 等細(xì)胞因子，通過(guò) ELISA 檢測(cè) IL-6 濃度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線推算熱原含量。即使 LPS 因 LER 改變超分子結(jié)構(gòu)，只要仍具生物活性，就能被 MAT 法識(shí)別。這種 “檢測(cè)活性而非結(jié)構(gòu)” 的特性，使 MAT 法成為 LER 場(chǎng)景下內(nèi)毒素檢測(cè)的重要補(bǔ)充，與其他方法協(xié)同構(gòu)建高效可靠的熱原防控體系。

內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑的反應(yīng)受pH的干擾。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，要調(diào)節(jié)被測(cè)溶液的pH值，使鱟試劑與供試品溶液的混合溶液pH值落在鱟試劑指定的使用pH范圍內(nèi)（一般鱟試劑作用pH值在6.0~8.0范圍內(nèi))。用于調(diào)節(jié)pH值的試液或溶液（酸或堿)，可采用BET用水配制，并將溶液在無(wú)熱原容器中儲(chǔ)存；必須對(duì)試液或溶液進(jìn)行驗(yàn)證，以證明不含可檢出的內(nèi)毒素并且無(wú)干擾因素。調(diào)節(jié)pH試劑（酸或堿）的添加量，不應(yīng)該超過(guò)供試品的1092。如果超過(guò)10%，則在進(jìn)行計(jì)算時(shí)，將DH試劑的添加量的系數(shù)計(jì)算進(jìn)去。

低內(nèi)毒素回收（LER）又稱內(nèi)毒素掩蔽，是指無(wú)菌制劑（尤其蛋白類生物制劑）進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，加標(biāo)內(nèi)毒素的回收率＜50% 的現(xiàn)象，且無(wú)法通過(guò)稀釋排除，區(qū)別于傳統(tǒng)檢測(cè)干擾。LER 會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素污染被低估，已被全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注：FDA 2013 年要求生物藥 BLA 申報(bào)時(shí)提交 LER 研究報(bào)告；EMA 2023 年明確含表面活性劑（如吐溫）或螯合劑（如 EDTA）的制劑需提供 LER 數(shù)據(jù)；中國(guó)藥典 2025 版 9251 通則也新增 LER 內(nèi)容，與國(guó)際接軌。這些要求促使企業(yè)優(yōu)化內(nèi)毒素檢測(cè)流程，避免因 LER 導(dǎo)致的檢測(cè)偏差，確保藥品安全。