上海醫(yī)療器械熱原檢測風險評估

來源： 發(fā)布時間：2025-12-03

MAT 法熱原檢測標曲采用非倍比稀釋，而非 1-0.5-0.25 的倍比稀釋，主要優(yōu)勢在于提升標曲準確性與適用性，避免稀釋誤差影響。一是可密集覆蓋關鍵濃度區(qū)間：熱原檢測的重點關注區(qū)為低濃度拐點（如 0.0125-0.1EU/mL）與高濃度平臺區(qū)（如 0.5-1EU/mL），非倍比稀釋可在這些區(qū)間設置更多濃度點（如 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1EU/mL），提升曲線擬合精度，而倍比稀釋低濃度點少，易導致低濃度熱原定量不準。二是降低稀釋誤差累積：倍比稀釋需連續(xù)稀釋（如 1EU/mL→0.5EU/mL→0.25EU/mL），每一步誤差會累積，導致低濃度點實際濃度偏離理論值；非倍比稀釋通過單獨配制每個濃度點（如直接用標準品配制 0.025EU/mL），避免誤差累積，提升標曲可靠性。三是適配不同樣品濃度：非倍比稀釋可根據(jù)樣品預期濃度調整標曲范圍，如樣品預期濃度 0.05EU/mL，可增加 0.025、0.05、0.1EU/mL 點，確保樣品濃度落在標曲線性區(qū)，而倍比稀釋范圍固定，靈活性差。這些優(yōu)勢使非倍比稀釋成為 MAT 法標曲配制的優(yōu)先選擇方式。
細胞因子IL-6因穩(wěn)定性高、半衰期長，被選為熱原檢測MAT法關鍵定量指標，優(yōu)于TNF-α與IL-1β。上海醫(yī)療器械熱原檢測風險評估

上海醫(yī)療器械熱原檢測風險評估,熱原檢測

熱原是能引發(fā)恒溫動物體溫異常升高的物質總稱，主要成分為細菌內毒素（革蘭氏陰性菌脂多糖 LPS），同時涵蓋病毒、真菌毒素、支原體等非內毒素熱原，其檢測是保障藥品與醫(yī)療器械安全性的關鍵環(huán)節(jié)。當前熱原檢測已形成 “特異性檢測 + 廣譜篩查” 互補的完整體系：以鱟試驗法（含天然 LAL 與重組 rCR/rFC 試劑）作為細菌內毒素的特異性檢測手段，憑借 fg 級靈敏度成為制藥行業(yè)常規(guī)質控方法，可通過凝膠法實現(xiàn)定性、動態(tài)濁度 / 顯色法完成定量；以家兔熱原試驗作為傳統(tǒng)廣譜篩查方法，雖操作繁瑣（需預試篩選基礎體溫穩(wěn)定家兔，正式試驗觀察 3 小時體溫變化），但仍是放射性質的藥物、血液制品等高風險產品排除非內毒素熱原的補充手段；以單核細胞活化反應測定（MAT）作為新興全熱原檢測技術，利用人源單核細胞（如 THP-1 細胞）釋放 IL-6、TNF-α 等細胞因子的特性，可同時識別內毒素與非內毒素熱原，契合疫苗、基因治療產品等對風險控制的需求。三種方法協(xié)同應用，從原料入廠到成品放行構建全流程熱原防控網(wǎng)絡，既保證對內毒素的準確監(jiān)控，又避免非內毒素熱原的遺漏風險。
抗體藥物熱原檢測流程熱原檢測實驗中，標準化培養(yǎng)基與恒定環(huán)境讓單核細胞系活性穩(wěn)定，避免PBMC凍存后的功能衰減。

上海醫(yī)療器械熱原檢測風險評估,熱原檢測

相較于傳統(tǒng)家兔法，熱原檢測MAT法在動物福利、檢測性能、適用范圍等方面具有明顯優(yōu)勢。從動物福利看，MAT法使用分離培養(yǎng)的單核細胞系（如湖州申科 HL-60 細胞系），無需動物，完全符合 “減少、替代、優(yōu)化” 的 3R 原則，規(guī)避家兔法的倫理爭議與飼養(yǎng)成本。檢測性能上，家兔法只能定性且靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），結果受動物個體差異、環(huán)境溫度影響大；MAT 法可定量檢測，標曲線性范圍 0.0125-1.0EU/mL，檢測限（LOD）達 0.0125EU/mL，批間 CV≤25%，重復性更優(yōu)。適用范圍方面，家兔法不適用于放射性質藥物、基因療法制劑等可能影響動物體溫的產品；MAT法適配疫苗、血制品、抗體藥、化藥等幾乎所有類型樣品，且支持高通量檢測，單塊 96 孔板可同時分析多個樣品，檢測時間從家兔法的3-7天縮短至1.5天，大幅提升效率。

MAT 試劑盒熱原檢測配套細胞的質量控制，是保障檢測結果可靠的重要環(huán)節(jié)，需從功能、安全性、穩(wěn)定性三方面建立體系。在功能鑒定上，按歐洲 MAT 法要求，需檢測細胞的 Toll 樣受體（TLR1-TLR9）表達情況—確保細胞能響應不同類型熱原（如 TLR4 響應 LPS、TLR2/6 響應脂磷壁酸）；同時考察細胞倍增時間（確?；钚苑€(wěn)定）、熱原反應性（對標準內毒素和非內毒素熱原的信號強度），確保細胞具備熱原識別與炎癥因子分泌能力。在安全性檢測上，需驗證細胞無菌（無細菌、真菌污染）、無支原體、無外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝桿菌，避免外源污染影響檢測結果。在穩(wěn)定性考察上，需監(jiān)測不同代次細胞的熱原刺激敏感性，一般要求細胞使用代次不超過 20 代，代次過高會導致 TLR 表達下降、炎癥因子分泌減少，影響檢測靈敏度。湖州申科的配套細胞還額外通過 Western blot 驗證 TLR 受體表達量，并用不同非內毒素熱原配體刺激驗證響應性，形成全維度質量控制，確保細胞適配熱原檢測需求。
單核細胞活化試驗MAT通過量化人源單核細胞的免疫應答，實現(xiàn)對LPS、脂磷壁酸、β-葡聚糖的同步檢測。

上海醫(yī)療器械熱原檢測風險評估,熱原檢測

PBMC（外周血單個核細胞）用于 MAT 熱原檢測時，存在異質性與血源供應兩大關鍵問題。從異質性來看，PBMC 含 12% 單核細胞與 88% 淋巴細胞，且來自不同供體，細胞組成、功能狀態(tài)及熱原反應存在明顯差異，導致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動大，標準化難度高。血源供應方面，除受獻血者數(shù)量、時間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴格檢測乙肝、丙肝等標志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無菌操作，流程環(huán)節(jié)多、復雜度高，遠不及單核細胞系制備簡便，易影響熱原檢測的時效性與穩(wěn)定性。MAT 熱原檢測能幫助分析和解決生物制品生產中出現(xiàn)的低內毒素回收（LER）現(xiàn)象。江蘇生物制品熱原檢測結果判定

無論是注射劑、生物制品，還是醫(yī)療器械的接觸材料，都能在我們的熱原檢測下，得到準確的“安全認證”。上海醫(yī)療器械熱原檢測風險評估

中國藥典與歐洲藥典對 MAT 熱原檢測的細胞類型及復孔數(shù)有明確要求，且存在細節(jié)差異。細胞類型上，兩者均認可人全血、PBMC（外周血單個核細胞，至少 4 個供體，歐洲藥典建議 8 個供體），中國藥典明確將單核細胞系納入，歐洲藥典則要求單核細胞系需做支原體污染檢測、細胞鑒別等；檢測方法均為 “熱原刺激細胞 + ELISA 檢測 IL-6/IL-1β/TNF-α”。復孔數(shù)方面，兩者均規(guī)定平行孔≥4、濃度點≥4，中國藥典額外要求標曲 r≥0.90，主要目的是通過多重復孔抵消 PBMC 的不穩(wěn)定性，確保熱原檢測結果準確可靠。
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